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T4 GP61 Primase公司正在出售的產(chǎn)品:大鼠乳腺癌細胞 干擾alpha 14蛋白封閉多肽 愛德華氏菌通用PCR檢測試劑盒 大鼠維生E(VE)試劑盒 ELISA 土壤脲(SUE)活性比色法檢測試劑盒 駱駝刺中慢生根瘤菌 脫髓鞘相關(guān)蛋白SH3TC2N抗體
更新時間:2024-01-14
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
A-PJ1142 | T4 GP61 Primase | 100 ug |
描述:T4 噬菌體復(fù)制分為依賴于起始子的起始復(fù)制和依賴于重組酶的復(fù)制。由起始復(fù)制產(chǎn)生的 3’-ssDNA 作為重組復(fù)制的第一步鏈侵入的組份,該 3’-ssDNA 被 T4 gp32蛋白所覆蓋,同時將 T4 UvsY 募集到此;T4 UvsY 作為T4 UvsX 的 loader 將其運載至此,于此同時 gp32 被置換下來, UvsX 和 UvsY 形成突觸結(jié)構(gòu), 然后侵入同源的雙鏈形成 D-Loop, 一旦形成 D-Loop, UvsX 即被置換下來。D-loop 被置換鏈作為滯后鏈合成的模板,很快被gp32 結(jié)合。隨后, 解旋酶 loader gp59 與 gp32 覆蓋的DNA 復(fù)制叉結(jié)合,將 gp41/61 運載至此, gp61 引發(fā)酶可合成引物片段促進滯后鏈上 DNA 的合成,而 gp41 通過解旋模板而促進先導(dǎo)鏈的 DNA 合成。最后,聚合酶的滑板蛋白 gp45 和其 loder 蛋白 gp44/62 與先導(dǎo)鏈相結(jié)合,促進聚合酶 gp43 的組裝,gp45 將 gp43 運載至復(fù)制叉處后啟動先導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成,gp44/62 隨后從復(fù)制叉處解離。gp61 引發(fā)酶可合成寡核苷酸用于引發(fā)滯后鏈上岡崎片段的合成,因此,gp61 引發(fā)酶在 T4 噬菌體 DNA滯后鏈的合成中起重要作用。
儲存:-20℃。
Storage Buffer:
20mM Tris-HCl,pH7.5
200mM NaCl
5mM DTT
50% Glycerol
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備?
試劑:
模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應(yīng)的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟,常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準,用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;
設(shè)備:
PCR儀:用于控制反應(yīng)溫度,保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,才能進行PCR反應(yīng)并得出準確結(jié)果。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗:
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈式反應(yīng)由20到35個循環(huán)組成,每個循環(huán)包括以下3個步驟:
一、變性:
利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。
二、退火或稱接合,復(fù)性:
在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。
三、延伸:
DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:
1、變性溫度和時間:
保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。
2、復(fù)性溫度和時間:
PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。
3、延伸溫度和時間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間,可根據(jù)待擴增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。
4、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴增增加。
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